PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來源及控制措施都有哪些？
發(fā)布時(shí)間：2021-07-29 16:08
PCR實(shí)驗(yàn)室又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。能夠通過DNA基因追蹤系統(tǒng)來掌握患者體內(nèi)的病毒含量。它最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是容易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。那么PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來源及控制措施都有哪些呢？
一、PCR實(shí)驗(yàn)室被污染的原因
1、標(biāo)本間交叉污染
標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染。標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染。有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。
2、PCR試劑的污染
主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染
這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/mL)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)性。
4、實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。
二、防止污染的方法
進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。
(一) 劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
1、試劑準(zhǔn)備區(qū)。
2、標(biāo)本制備區(qū)。
3、PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。
各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：試劑準(zhǔn)備→標(biāo)準(zhǔn)制備→PCR擴(kuò)增區(qū)及分析區(qū)。
切記：任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。
(二) 分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA：
1、PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水。
2、引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制。
3、引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。
(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)
盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
1、戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套。
2、使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。
3、避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。
4、操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。
5、最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。
6、操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。
7、盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)。
8、重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
以上就是PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來源及控制措施。更多實(shí)驗(yàn)室相關(guān)產(chǎn)品信息，敬請(qǐng)關(guān)注河南中潤(rùn)實(shí)驗(yàn)工程公司官網(wǎng)，產(chǎn)品咨詢及實(shí)驗(yàn)室EPC設(shè)計(jì)建設(shè)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站客服。
